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PCR擴增試劑盒實驗擴增產物出現雜帶的處理

更新時間:2022-08-23點擊次數:1063
   PCR擴增試劑盒的標準品(凍干品)臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為200 U/L,然后做系列倍比稀釋,分別配制成200 U/L,100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,樣品稀釋液直接作為空白孔0 U/L。如配制100 U/L標準品則取0.3ml(不要少于0.3ml)200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
  PCR擴增試劑盒使用時要注意基礎程序、擴增溫度和延伸溫度、反應時間、循環次數、PCR反應液的配制、PCR的反應動力學、PCR擴增產物以及PCR反應體系與反應條件。
  若在進行PCR實驗時擴增產物出現雜帶該如何處理?
  對于該現象可能的原因和對應的處理策略如下:
  1.引物用量偏大,引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。
  2.循環的次數過多。適當增加模板的量,減少循環次數。
  3.酶的用量偏高或酶的質量不好,應降低酶量或調換另一來源的酶。
  4.退火溫度偏低,退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度,減少變性與延伸時間,也可采用二種溫度的PCR擴增。以2℃為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。
  5.樣品處理不當。
  6.Mg2+濃度偏高,因適當調整Mg2+使用濃度。
  7.若為PCR試劑盒,也可能時試劑盒本身質量有問題。推薦使用PCR擴增試劑盒,添加改良的DNA聚合酶,大大提高擴增產物的特異性和保真性。

TEL:021-61210612

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